大家好，我是你们的实验助手。在上一期中，我们讨论了检测细胞凋亡的各种方法。在这一期内，我们将专注于用于检测细胞凋亡的TUNEL实验，并分析实验中TUNEL染色结果失败的原因。首先，我们来了解TUNEL染色过程的步骤，如下图所示。

图1. TUNEL染色程序（注：核染色步骤是可选的）

在使用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡时，需要使用蛋白酶K、荧光素-dUTP、末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT酶）等各种试剂。此外，还需要设置阳性和阴性对照组。面对复杂的染色步骤，许多人都表示感到困惑。下面，我们将逐一提供答案。

TUNEL检测试剂盒的主要组成成分及其功能

1) 平衡缓冲液：用于维持一定的反应条件，缓冲液中的Mg2+可以减少背景噪声，而Mn2+则增强染色效率。

2) 蛋白酶K：渗透细胞膜和核膜，确保TUNEL探针能够进入细胞并确保足够的染色。

3) 荧光素-dUTP：标记3'-OH末端，作为TdT酶的底物。

4) TdT酶：关键酶，催化将dUTP标记在3'-OH末端。

阳性对照组、阴性对照组、实验组

1) 阳性对照组：用DNase酶处理以诱导细胞凋亡并暴露3'-OH末端。每个实验准备一个样本。

2) 阴性对照组：不添加TdT酶，其他步骤与实验组相同。每种类型的组织样本需要一个阴性对照。例如，如果有5个来自小鼠的肺组织切片，那么就需要5个阴性对照样本。

3) 实验组：除了阳性和阴性对照组之外，所有其他样本都被视为实验组。

为什么要设置阳性对照组和阴性对照组

1) 阳性对照组：用于验证实验步骤和试剂盒是否存在问题。

2) 阴性对照组：a. 排除由于细胞凋亡和实验过程本身等原因引起的非特异性染色。b. 在成像过程中调整曝光强度。

此外，人们可能会遇到各种染色结果的问题，包括荧光信号弱、无荧光信号、假阳性高、荧光背景强等。染色失败的主要原因包括样本处理不当、染色不足、曝光时间过长等。这些问题可以从以下几个方面进行分析和解决。

荧光信号弱或缺失

如果已知细胞或组织样本处于凋亡状态，但在使用TUNEL试剂盒时发现荧光信号弱或缺失。

4.1 样本处理不当
1) 样本切片太厚。建议稍微切薄切片以获得更好的染色效果。

2) 去石蜡和水化不充分。建议在60°C下去石蜡20分钟，然后使用二甲苯两次，每次5-10分钟；水化时使用从高到低浓度的乙醇梯度。

3) 蛋白酶K孵育时间太短。优化蛋白酶K的孵育时间，通常使用的时间为10-30分钟。大约4微米的切片通常孵育10分钟，而大约30微米的切片孵育30分钟。

4) 蛋白酶K浓度太低。建议使用20微克/毫升的工作浓度的蛋白酶K。

5) 切片在-20°C下存放时间过长可能不够新鲜，降低了染色效率。建议使用新鲜的切片。
 

4.2 染色步骤不当
6) 染色时间太短。建议在37°C下孵育60分钟，根据凋亡损伤的程度，可以延长至2小时，但要注意背景染色。

7) TdT酶或荧光标记的dUTP浓度太低。建议适当增加TdT酶或荧光标记的dUTP的浓度。

8) TdT酶失活。建议在使用前立即准备TUNEL反应溶液，并短暂存放在冰上。长时间存放可能导致TdT酶失活。

9) 样本干燥。加入TUNEL反应溶液后，用盖玻片/膜/湿盒覆盖玻片，以确保样本均匀染色，并防止反应溶液干燥。
 

4.3 荧光检测步骤不当
10) 操作时没有避光。由于荧光的脆弱性，建议在标记和检测样本时避免光线照射，并尽快进行观察。

非特异性染色（假阳性率高）

如果已知细胞或组织样本仍然处于活细胞状态，但使用TUNEL试剂盒时却发生了非特异性染色，显示出与处理过的样本相似甚至比阳性对照组的荧光信号更强的荧光信号。

5.1 样本处理不当
1) 使用酸性或碱性固定液可能会导致DNA损伤。建议使用中性pH值的固定液来固定组织或细胞。

2) 固定液浓度过高可能会导致细胞自溶，DNA链不规则断裂，引起假阳性。建议使用4%的多聚甲醛溶液（溶于PBS中）。

3) 固定时间过长可能会导致细胞自溶，DNA链不规则断裂，引起假阳性。建议将固定时间控制在4°C下25分钟。

4) 蛋白酶K处理时间过长可能会破坏核酸结构，导致假阳性。建议适当缩短处理时间。

5) 蛋白酶K浓度过高可能会破坏核酸结构，导致假阳性。建议适当调整蛋白酶K溶液的浓度，一般工作浓度为20微克/毫升。
 

5.2 染色步骤不当
6) TUNEL染色时间过长。通常建议在37°C下孵育60分钟，根据凋亡损伤的程度可以延长至2小时，但应结合背景染色情况。

7) 样本清洗不充分。染色后，增加PBS冲洗次数至5次，以避免切片的非特异性染色。

强烈的荧光背景

6.1 不正确的染色程序
1) TUNEL染色时间过长。建议适当调整染色时间，通常在37°C下孵育60分钟，以避免背景染色。

2) TUNEL染色溶液浓度过高。建议增加稀释比例以优化浓度。

3) 使用试剂盒中提供的二价阳离子来优化反应。试剂盒中的Mg2+可以减少背景，而Mn2+可以增强染色效率。

4) 用PBS洗涤样品不足。在TUNEL反应后，将PBS洗涤次数增加到5次，以去除组织切片中残留的染料。

6.2 不正确的荧光检测操作
5) 曝光时间过长。首先通过优化负对照组无背景光的曝光条件，然后使用这些曝光条件来捕获实验组的图像（可能需要微调，但不需要大幅度调整）。