免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）是根据抗原及抗体间专一性结合反应的原理，使用荧光抗体或染料来检测细胞内靶抗原（如蛋白）的技术，其所需样品为细胞，因常使用荧光标记所以在应用上常常写成ICC/IF。由于ICC/IF具有特异性强、敏感性高、速度快等优点，又可以完整观察细胞型态与目标抗原相对位置，因此被广泛应用于科研领域。
ICC步骤如下图所示，需将细胞固定在盖玻片上经过通透、一抗二抗染色等步骤, 最后成像。
GeneTex可提供一系列用于ICC的优质抗体，对于ICC实验有着丰富的经验。在此与大家分享当遇到ICC染色形态不佳/信号定位不正确的情况，应该如何解决？
检查以下2点，一切都搞定！
1、检查细胞爬片 2、检查固定与通透
1、细胞爬片制备
重点1.1、细胞黏附好，形态才会好
a、盖玻片处理： 通常细胞在盖玻片上的黏附能力都不强，可以使用几种成分铺在盖玻片上，以增强细胞与玻璃盖玻片的黏附。常用的溶液成分如下表，不同的细胞需进行个别的调整，以得到最佳的结果。
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一般药品 |
细胞外基质蛋白 |
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Poly-lysine (0.05-0.1mg/ml) |
Laminin (0.05-0.1mg/ml) |
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Poly-ornithine (0.1mg/ml) |
Fibronectin (0.05-0.1mg/ml) |
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HCl (0.1-1M) |
Gelatin (0.1%) Collagen (0.05-0.1g/ml) |
b、细胞状态和密度：细胞的健康状态、型态与密度，可能会影响靶标蛋白的表达与定位。一般使用分盘后培养隔夜(时间太短细胞贴附不完全，太长细胞会太老不健康)，细胞密度约50-70 %的爬片。密度太高或太低都可能对靶标蛋白的定位产生负面的影响，需要根据靶标特性调整适宜的细胞类型与密度。例如在研究细胞连接标记蛋白时，维持细胞与细胞间的接触就特别重要，选择较容易观察到细胞连接的细胞种类，最佳细胞密度也要有80%以上。
c、细胞培养条件：有些靶标蛋白的表达和定位，随着细胞周期或细胞应激反应而变化，须确保用来制作爬片的细胞状态为观察靶标蛋白的最佳条件。例如观察细胞分裂相关蛋白，可将细胞做同步处理，使细胞处于同一个细胞周期阶段，否则就需要在细胞爬片中仔细观察靶标蛋白的信号；又如观察自噬反应中的LC3B蛋白，如未加入诱发细胞展开自噬的药物，将较难观察到正确的定位结果。
重点1.2、悬浮细胞有诀窍
a、分盘时，将细胞悬浮溶液接种于涂层处理过的盖玻片上，接着即可比照黏附型细胞的实验步骤。
b、在细胞悬浮溶液中进行固定步骤，利用细胞离心技术（CytospinTM）将细胞低速离心至涂层处理过的盖玻片上，也可以用移液管吸取细胞悬浮液滴于已涂层的盖玻片上。
c、在悬浮状态中进行完所有染色步骤，最后用移液管移至器皿或载玻片上进行显微镜成像。
d、小星狮技巧：可以将固定后的悬浮细胞溶液与2-3 %的琼脂等比例混合，将细胞检体包覆，待琼脂胶体凝固后，再按照常规的脱水、包埋程序做石蜡包埋，制作成的细胞蜡块，之后再进行组织切片，此玻片样本可照一般石蜡组织切片IHC的操作方法进行免疫化学染色。与一般ICC最大的不同为：此组织蜡块制作的玻片需烤过，再进行脱蜡与回水，也需要进行抗原修复的步骤，基本上是当作IHC进行实验，对于较难得到的细胞样本（如病毒感染的细胞），可用此方法保存细胞蜡块，日后若有需要只要进行切片即有样本。
2、固定和通透处理
样品的固定与通透对实验结果影响很大，最适合的固定与通透方法，与细胞类型、靶标蛋白和使用的抗体有关，尝试不同的固定和通透条件，将有助于得到靶标蛋白在抗体染色的最佳信号与正确定位。
a、固定剂的选择：固定剂主要有两大类，交联剂（如多聚甲醛）与有机溶剂（如甲醇或丙酮）。
交联剂通过疏水性交联把蛋白与蛋白连起来；有机溶剂能使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上，也具有细胞通透的性能。多聚甲醛、甲醇和丙酮等都是很常用的固定剂，建议最初从4% PFA，固定15分钟开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂。
GeneTex在固定剂的使用经验整理如下表，但仍须根据靶标蛋白或抗体的不同逐步调整出最佳方案。
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靶标蛋白类型 |
较合适固定剂 |
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细胞膜 |
交联剂 |
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细胞质 |
交联剂/有机溶剂 |
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细胞骨架 |
有机溶剂/交联剂 |
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高尔基体 |
交联剂/有机溶剂 |
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细胞核 |
交联剂 |
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细胞核膜 |
有机溶剂/交联剂 |
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细胞核仁 |
有机溶剂 |
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内质网 |
交联剂 |
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中心体 |
有机溶剂 |
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纺锤体 |
有机溶剂/交联剂 |
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溶酶体 |
有机溶剂/交联剂 |
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线粒体 |
有机溶剂 |
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自噬体 |
有机溶剂 |
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翻译后修饰化靶标蛋白（PTM） |
交联剂 |
b、通透条件的选择：
由于抗体无法直接穿过数十微米的细胞质膜进入细胞，因此检测胞内的靶标蛋白时，需进行通透化处理，利用除垢剂在细胞膜形成孔洞，使得抗体得以进入细胞内。常用的除垢剂有Triton® X-100, NP-40, Tween 20或皂甘等，建议从0.1 % Triton® X-100，通透5分钟开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整通透时间或通透剂浓度，也可以考虑更换另一种通透剂，有机溶剂固定剂会引发细胞变性脱水，因此也会破坏细胞膜的完整性，不太适合细胞膜靶标蛋白染色。一般来说，有机溶剂固定之后也不建议进行细胞通透的步骤。最佳的细胞通透方法，一样需要根据靶标蛋白与所使用的抗体而调整，无法用一种方法套用到所有的实验
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