反转录（ReverseTranscription,RT），是将RNA转化为cDNA的关键步骤，广泛应用于qPCR、基因克隆、测序等下游实验。然而，实验过程中常会遇到各种问题。今天，我们就来详细盘点反转录实验中的常见问题，分析可能的原因，探讨解决方法，让你的实验顺利推进！

01 反转录产物无或产量低

1.RNA质量不合格

RNA降解（提取过程未严格防止RNase污染）；RNA纯度低（A260/A280或A260/A230比值异常）；样本储存不当（反复冻融或长期存放于20℃）。

解决方案：

使用新鲜提取的RNA，避免反复冻融，长期储存建议80℃；可通过跑胶检查RNA完整性，真核生物28S与18S条带亮度约为2:1；确保A260/A280在1.8-2.0，过低可能含蛋白/酚污染，A260/A230最好大于2.0，小于1.6说明有盐或有机物严重残留）。

2.反转录酶活性不足

酶储存不当，反复冻融或长期置于4℃；反应体系未优化，受酶量不足或Buffer成分影响；反应温度不合适。

解决方案：

分装保存反转录酶，避免反复冻融，通常20℃长期储存）；按照说明书推荐比例使用酶，必要时提高酶量（尤其对于较难进行反转录的GC含量较高的RNA）；根据样本特点选择合适的反转录酶。

3.引物选择不当

随机引物对长RNA覆盖不全；Oligo(dT)引物不适合无Poly(A)尾的RNA（如原核RNA）。

解决方案：

对真核mRNA：Oligo(dT)+随机引物组合提高覆盖率；对原核RNA或病毒RNA：优先使用基因特异性引物或随机引物。

02 反转录有产物但无法成功PCR

1.cDNA合成不完整

反转录温度或时间不足，尤其对于长片段或复杂RNA；RNA二级结构未充分变性；引物与模板互补性不好。

解决方案：

提高反转录温度（通常50-55℃）；预变性RNA（65℃5min后迅速冰浴，破坏二级结构）；确保引物与模板的互补性良好，从引物设计和反应条件考虑，避免引物二聚体的形成影响结合。

2.反转录产物含抑制剂

反转录体系中残留乙醇、盐或SDS等污染物；cDNA未纯化直接用于PCR（某些酶Buffer抑制Taq酶）。

解决方案：

使用柱式纯化或乙醇沉淀去除抑制剂；若直接使用cDNA，建议稀释后进行PCR，以降低抑制剂对PCR的影响。

03 特殊样本的反转录优化

1.低丰度RNA

增加RNA起始量；使用高效率、高灵敏度的反转录酶，以反转录低丰度RNA。

2.高GC或复杂结构RNA

在反转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却；通过在较高的温度下（例如50℃）进行反转录以最小化发夹序列形成的可能；使用能够承受高反应温度的热稳定反转录酶。

3.微量样本（如单细胞RNA）

RNA保护与防降解，在裂解液中加入RNase抑制剂；优先选择专为微量样本设计的酶；使用高灵敏度反转录酶。

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